พิพิธภัณฑ์ประวัติศาสตร์และวัฒนธรรมท้องถิ่นจังหวัดอุทัยธานี ได้จัดตั้งขึ้นเป็นทางการ เมื่อวันที่ 13 สิงหาคม 2525 โดยใช้ตัวอาคารเดิมของโรงเรียนเบญจมราชูทิศ ซึ่งเป็นอาคารไม้สองชั้น มีอายุกว่า 80 ปี เป็นที่จัดแสดงสิ่งต่างๆ ระหว่างวิชาการสิ่งแวดล้อม และศิลปวัฒนธรรมท้องถิ่น ตลอดจนชีวิตความเป็นอยู่ของชาวอุทัยธานีในอดีตและปัจจุบัน

ภายในแบ่งเป็น 4 ห้อง ดังนี้

ห้องอุทัยธานียุคก่อนประวัติศาสตร์ เป็นการจัดแสดงโครงกระดูกมนุษย์ ภาชนะดินเผา เครื่องประดับลูกปัดหินสี จากแหล่งโบราณคดีบ้านหลุมเข้า อำเภอหนองขาหย่าง จังหวัดอุทัยธานี

ห้องอุทัยธานีกับยุคทวารวดี จัดแสดงวัตถุโบราณยุคทวารวดีในชุมชนต่างๆ เช่น ระฆังหิน หลักศิลาจารึกอักษรปัลลวะ 3 หลัก พบที่เมืองโบราณบ้านบึงคอกช้าง อำเภอสว่างอารมณ์

ห้องวิวัฒนาการทางเทคโนโลยี จัดแสดงเครื่องมือเครื่องใช้ และอาวุธโบราณ ที่แสดงให้เห้นถึงวิวัฒนาการทางเทคโนโลยี ความเจริญก้าวหน้าของมนุษย์ เช่น เครื่องพิมพ์ดีดภาษาไทยรุ่นแรกที่มีในสยาม เป็นต้น

ห้องมรดกโลกห้วยขาแข้ง จัดแสดงป่าจำลองมรดกโลกห้วยขาแข้งและนิทรรศการ สืบ นาคะเสถียร